Nuclear factor kappa Β in the dorsal raphe of macaques: an anatomical link for steroids, cytokines and serotonin

Nuclear factor kappa Β in the dorsal raphe of macaques: an anatomical link for steroids, cytokines and serotonin

PDF

J Psychiatry Neurosci 2006;31(2):105-14

Cynthia L. Bethea, PhD; Arubala P. Reddy, MS; Lisa J. Smith, BS

Bethea, Reddy, Smith — Division of Reproductive Sciences; Bethea — Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University, Beaverton, Ore.

Abstract

Objective: Nuclear factor kappa B (NFκB) is a transcription factor that activates gene expression in response to proinflammatory cytokines, and elevated cytokines are associated with depression, which has a serotonergic component. We questioned (1) whether serotonin neurons contain NFκB, (2) whether NFκB detection with immunocytochemistry is changed in the dorsal raphe nucleus (DRN) by ovarian hormone treatment and (3) whether ovarian hormones regulate midbrain NFκB gene or protein expression.
Methods: Monkeys were spayed and treated with placebo, estrogen (E), progesterone (P) or E+P for 1 month (n = 4 animals/treatment group), and the midbrain was harvested for immunocytochemistry and stereology. An antibody that detects nuclear location-specific (NLS)-NFκB p65 was applied, and the numbers of NLS-NFκB-immunopositive cells were counted in 9 sections of the DRN. Additional monkeys were used for Western blot analysis and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for NFκB p65.
Results: In placebo-treated macaques, neurons were double-immunostained for serotonin and nuclear NFκB p65 throughout the DRN. The mean total number of NFκB-positive cells equalled 2178 (and standard error of the mean [SEM] 129) in the placebo group, 1631 (SEM 221) in the E-treated group, 2314 (SEM 186) in the P-treated group and 1162 (SEM 100) in the E+P-treated group (analysis of variance p = 0.003). The E-treated and E+P-treated groups had a significantly lower density of cells stained positive for NFκB than the placebo or P-treated groups (post hoc). Unmasking of NLS-NFκB immunostaining in the DRN revealed dense immunostaining in the cytoplasm of large dorsal raphe neurons. There was no difference between treatment groups in the amount of NFκB p65 detected by Western blot or in the relative expression of NFκB p65 mRNA with quantitative RT-PCR.
Conclusions: These observations are consistent with the notion that gene and protein expression of NFκB are constitutive but that ovarian hormones can decrease the nuclear location of NFκB in dorsal raphe neurons and, thereby, decrease the ability of NFκB to drive gene expression in response to cytokines.

Résumé

Objectif : Le facteur nucléaire kappa B (NFκB) est un facteur de transcription qui active l’expression génique en réponse à des cytokines pro-inflammatoires, et l’élévation des cytokines est associée à la dépression, qui comporte un élément constituant sérotoninergique. Nous avons cherché à savoir (1) si les neurones à sérotoninergiques contiennent du NFκB, (2) si un traitement aux hormones ovariennes modifie la détection du NFκB par immunocytochimie dans le noyau du raphé dorsal (NRD) et (3) si les hormones ovariennes assurent la régulation de l’expression génique ou protéique du NFκB dans le mésencéphale.
Méthodes : On a pratiqué une ovariectomie sur des guenons auxquelles on a administré un placebo, de l’œstrogène (E), de la progestérone (P) ou une combinaison E+P pendant un mois (n = 4 animaux/groupe de traitement). On a prélevé ensuite le mésencéphale pour effectuer des tests d’immunocytochimie et de stéréologie. On a appliqué un anticorps qui détecte le NFκB p65 nucléaire à localisation spécifique (NLS) et compté le nombre de cellules immunopositives pour le NLS-NFκB dans 9 coupes du NRD. On a utilisé d’autres sujets pour procéder à une analyse quantitative par transfert de Western et réaction en chaîne de la polymérase par transcription inverse (RT-PCR) pour le NFκB p65.
Résultats : Chez les macaques traitées par placebo, on a soumis les neurones à une immunocoloration double pour la sérotonine et le NFκB p65 nucléaire dans tout le NRD. Le nombre total moyen de cellules positives pour le NFκB a atteint 2178 (et l’erreur type de la moyenne [ETM], 129) chez les sujets traités par placebo, 1631 (ETM 221) chez ceux qui ont reçu de l’œstrogène, 2314 (ETM 186) chez ceux qui ont reçu de la progestérone et 1162 (ETM 100) chez les sujets traités par la combinaison E+P (analyse d’écart p = 0,003). Les groupes qui ont reçu de l’œstrogène et les sujets traités par la combinaison E+P avaient une densité significativement moindre de cellules colorées positivement pour le NFκB que le groupe traité par placebo ou les groupes traités par progestérone (a posteriori). Le démasquage de l’immunocoloration NLS-NFκB dans le NRD a révélé une immunocoloration dense dans le cytoplasme des gros neurones du raphé. On n’a constaté aucune différence entre les groupes quant à la quantité de NFκB p65 détecté par transfert de Western ou quant à l’expression relative de l’ARNM du NFκB p65 par la méthode RT-PCR quantitative.
Conclusions : Ces observations concordent avec le concept selon lequel l’expression génique et protéique du NFκB est constitutive, mais les hormones ovariennes peuvent réduire la localisation nucléaire du NFκB dans les neurones du raphé dorsal et, par conséquent, réduire la capacité du NFκB de catalyser l’expression génique en réponse aux cytokines.


Medical subject headings: blotting, Western; estrogen; immunohistochemistry; NF-kappa B; progesterone; serotonin; reverse transcriptase polymerase chain reaction.

Competing interests: None declared.

Submitted Oct. 7, 2005; Revised Nov. 14, 2005; Accepted Nov. 16, 2005

Correspondence to: Dr. Cynthia L. Bethea, Oregon National Primate Research Center, 505 NW 185th Ave., Beaverton OR 97006; fax 503 690-5384; betheac@ohsu.edu